作物基因组编辑态势迅猛！各大企业巨头如何布局？中国排名几何？
基因组编辑技术作为一项重要的新兴前沿技术，已在生命科学基础理论研究、经济物种的遗传改良以及人类健康等领域得到广泛应用，掀起了一场颠覆性的革命。
目前，一些利用这些技术研发的作物品种也已获得商业化许可，预计未来几年基因组编辑作物品种将在全球范围内快速发展。
由于基因组编辑技术显示出巨大优势，农业跨国企业纷纷调整战略布局，加大相关领域的各项投入，力图占领基因组编辑技术在农业领域发展和应用的主导地位。
基因组编辑技术，作为近年来飞速发展的一种对基因组DNA实现靶向修饰的新技术，相关研究始于20世纪80年代末，距今已有30年的发展历程。
目前，基因组编辑技术包括归巢核酸酶(meganucleases，MN)、锌指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated cas system，CRISPR/Cas)等四类。
在此背景下，本文对作物基因组编辑技术的研发现状、重要国家、重要机构和研究主题进行分析，让大家了解全球作物基因组编辑技术的发展和应用现状。
三阶段跨越
作物基因组编辑技术进入快速发展阶段
根据作物基因组编辑发文量的分布特点，其研究历程大致分为三个阶段。
▲作物基因组编辑技术文献年度分布
1993~2008年为起始阶段。此时，作物基因组编辑技术的相关研究论文数量较少，发文量均小于10篇。作物基因组编辑相关研究的首篇文章由法国巴斯德研究所的研究人员发表于1993年，涉及I-SceI诱导的双链DNA断裂可以提高烟草同源重组频率等内容，掀开了利用序列特异性核酸酶开展作物基因组精准操作时代的序幕。
2009~2012年为缓慢发展阶段。作物基因组编辑技术相关研究的发文量缓慢增长。相对而言，ZFN技术的发文数量较多，如2011年的最高发文量达到36篇，为该阶段研究较热的基因组编辑技术。
2013年至今为技术快速发展阶段。CRISPR/Cas9技术发展迅猛，其发文量呈指数增长趋势，2017年的发文量比2013年的发文量增长了近16倍。
其中，CRISPR最初是作为细菌的免疫防御系统而被发现的，其作为一种编辑工具的转折点是始于2012年的一项重要研究成果的报道，即Jennifer Doudna课题组将其改造为高效精准基因组编辑工具并在体外实验中验证成功。
在随后不到一年的时间里，麻省理工学院张锋团队和哈佛大学George Church团队先后发表了CRISPR/Cas9系统在小鼠和人类细胞中的应用，从而使该技术实现了在真核生物中的应用。同年，美国麻省总医院、塞恩斯伯里实验室和中国科学院等机构的研究人员分别利用CRISPR/Cas9技术在双子叶植物拟南芥、烟草及单子叶植物水稻、小麦中进行基因组修饰。
此后，世界各国研究人员开始聚焦这个新的研究领域，掀起了新一代基因组编辑的狂潮。
作物基因组编辑技术
的技术研发现状
从作物基因组编辑技术专利数量分布来看，CRISPR技术的专利数量最多，达1259件，占总量的46.68%；其次为MN技术，其专利数量达1104件，占总量的40.93%；ZFN技术的专利数量排名第三，为978件，占总量的36.26%；专利量最少的为TALEN技术，达751件，占总量的27.85%(各分支的专利之间有少量重叠)。
▲作物基因组编辑技术专利数量对比
MN技术的核心专利出现时间较早，集中分布在2002~2010年，并且近年来相关核心专利不再出现。
▲作物基因组编辑核心技术发展历程
MN技术核心专利主要掌握在拜耳、Cellectis和巴斯夫等公司手中，相关内容主要涉及利用归巢核酸酶进行精确的基因组重编程并开发出工业化生产核酸酶的方法、在预期位点修饰作物基因组的方法和通过同源重组对DNA实现靶向诱变等。
ZFN核心专利集中分布在2003~2008年，近年来未见该领域的核心专利出现。目前，ZFN技术主要被Sangamo公司掌控，内容涉及利用锌指核酸酶提高同源重组的方法、利用改造的锌指蛋白调控作物内源基因表达等。
TALEN核心专利主要分布在2009~2012年，此后无相关核心专利出现。目前，该技术主要掌握在2Blades、明尼苏达大学和爱荷华州立大学等公益性机构手中，并已被授权于多个农业领域领军企业，如拜耳、杜邦先锋和孟山都等。相关核心专利主要涉及TALEN技术的研发、利用TAL效应子的重复结构域选择性识别靶向DNA序列的方法等。
CRISPR技术核心专利自2013年后才出现，时间最晚，主要集中在Broad研究所、加州大学、哈佛大学和CRISPR Therapeutics等机构，技术内容涉及CRISPR-Cas载体系统和RNA直接靶向DNA修饰调控转录的方法、调控多种靶向核酸以及新的单分子向导RNA等方法、对新型的CRISPR酶及相关体系的研究等。
目前，有关CRISPR基因组编辑技术专利权归属上仍存在诸多争议。其中，Broad研究所获得美国的专利授权，加州大学伯克利分校获得中国和欧洲的专利授权，Cellectis等其他多方也声称拥有CRISPR的专利权。
专利研发主题的分析表明，作物基因组编辑技术研发主要涉及基因组编辑技术的方法和应用两大方面。
▲作物基因组编辑技术专利主题分布全景图
其中，红色圆圈代表基因组编辑技术相关的方法，如CRISPR，TALEN和ZFN等技术，技术热点涉及利用CRISPR技术靶向修饰位点、CRISPR核酸酶突变体、VI型CRISPR-Cas系统研究等。
蓝色圆圈代表基因组编辑技术相关的应用，热点涉及基因组编辑技术应用于雄性不育、抗逆性和抗除草剂等作物重要农艺性状改良研究。
▲作物基因组编辑技术专利TOP10申请国家
作物基因组编辑专利申请数量排名前10位的国家依次为：美国、法国、中国、德国、日本、比利时、瑞士、荷兰、韩国和英国。其中，美国的专利数量最多，达1088件，遥遥领先于其他国家。中国的专利申请数量排名第三位，达225件。
▲作物基因组编辑技术专利数量TOP10国家的技术分布
从技术分支上看，美国在4种不同的基因组编辑技术的布局较为均衡，且每类技术专利数量均排名第一；中国则偏重在CRISPR技术领域；法国和英国偏重在TALEN技术领域；德国和韩国偏重在MN技术领域。
▲作物基因组编辑技术TOP20专利申请机构
从专利数量排名TOP20机构来看，作物基因组编辑技术的专利申请机构主要来自美国、德国、法国、中国、奥利地和以色列五个国家，并且相关专利申请以企业为主。
法国Cellectis公司(280件)、美国陶氏益农公司(256件)和Sangamo公司(184件)的专利数量位居全球前三位，在该领域处于领先优势。
其中，Cellectis的技术研发主要集中在MN技术，陶氏益农的技术研发主要集中在ZFN，CRISPR和MN技术，Sangamo公司则集中在ZFN和MN等技术的研发与应用。
从合作关系上看，除加州大学和维也纳大学外，主要专利申请机构的合作网络主要以本国国内机构为主，合作多以“小团体”形式体现。
▲作物基因组编辑技术TOP20专利申请机构合作网络
其中，美国陶氏益农、Sangamo公司和Sigma-Aldrich公司之间，哈佛大学、麻省理工学院和Broad研究所之间，明尼苏达大学和爱荷华州立大学之间各形成3个合作团体。陶氏益农和Sangamo公司之间合作最频繁，双方在2008~2017年期间共申请84件专利，研究内容涉及锌指蛋白、靶向修饰及整合外源序列的方法和组合物等。
CRISPR是研究侧重点
中国后来居上
从作物基因组编辑技术各分支技术的文献数量来看，CRISPR相关研究的文献量最多，共447篇，占总量的36.14%；其次为ZFN技术，其相关研究的文献量为387篇，占总量的31.29%；文献量排第三的为TALEN技术，有286篇，占总量的23.12%；文献量最少的为MN技术，有147篇，占总量的11.80%。
▲作物基因组编辑技术文献量对比，各分支的文献之间有少量重叠
1993~2000年，相关研究热点主要集中在MN技术的作用原理或机制及其在作物中应用等。例如，研究发现来自酿酒酵母的I-SceI核酸内切酶可以诱导DNA双链断裂(DNAdouble-strandbreak，DSB)，可使同源重组频率提高几个数量级；此外，将目标载体通过农杆菌介导的方法在拟南芥、玉米等作物中进行稳定遗传转化，研究MN技术的功效也是研究热点之一。
2001~2009年，锌指核酸酶的研究最为活跃，基因组编辑技术的作用机制研究进一步深入，包括双链断裂机制、同源重组和晶体结构的研究；此时，基因组编辑技术也经历了从在模式作物中研究基因表达转变为在水稻等主要作物中基因突变的功能研究。
2010~2017年期间，TALEN和CRISPR技术相继出现，基因组编辑技术尤其是CRISPR/Cas9的优化改造和靶向诱变成为该时期的研究热点，具体内容包括对基因组编辑系统中的组成部分，如核酸酶、DNA结合特异性、III型效应子等改进研究，以增强识别特异性。
▲作物基因组编辑技术热点年度分布
以美国为代表的欧美发达国家在该领域具有较强的领先优势，我国后续发展迅速。法国于1993年最早发表了作物基因组编辑技术相关的研究论文，但其后续研究论文数量增长较为缓慢。
▲基因组编辑技术发文量年度变化趋势
美国自1996年开始开展了相关领域的研究，此后发文量呈快速增长趋势，并且位居全球前列。日本和德国分别在1997和1998年开始进行相关研究，但是后续研究发文量增长缓慢。
我国自2003年开始从事该领域的研究，尽管研究起步较晚，但是后续发展快速，2013年后的发文量几乎呈指数增长，并超越德国、法国和日本，2017年首次超过美国，成为该领域年度发文最多的国家。
从国家合作情况看，TOP20国家合作紧密，形成了一个来往密集的合作网络，其中方框大小代表发文量的多少，箭头粗细代表共同合作文章的密切程度。
▲作物基因组编辑技术发文TOP20国家合作网络
美国处于重要位置，与多个国家均有合作研究。其中，美国与中国合作论文的数量最多(75篇)，且主要集中在2011~2017年，研究内容涉及CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统和基因沉默等方向。
此外，美国和法国的合作研究也较多，共同发表了19篇研究论文，主要集中在2005~2016年，研究内容涉及TALEN鉴定工具、多重靶向基因组编辑、双向转录和阻遏系统等方向。
从发文量排名TOP10国家的四个分支文献量分布来看，美国、德国和法国在4种基因组编辑技术的布局较为均衡，其他国家则有所侧重。其中，中国、日本、英国和韩国偏重在CRISPR技术领域，印度和澳大利亚偏重在ZFN技术领域，加拿大偏重在MN技术领域。
▲作物基因组编辑技术文献量排名TOP10国家的技术分布
从发文量排名TOP20机构来看，作物基因组编辑技术的基础研究主要以科研机构和大学为主。其中，中国科学院(78篇)、爱荷华州立大学(54篇)和明尼苏达大学(48篇)的发文数量位居全球前三位；排第四位和第五位的分别是中国农业科学院(30篇)和马普协会(28篇)。
▲作物基因组编辑技术发文TOP20机构分析
尽管中国科学院、美国爱荷华州立大学和明尼苏达大学等机构在作物基因组编辑技术领域的基础研究具有明显优势，但是其侧重的技术分支各不相同。
其中，中国科学院在CRISPR，TALEN和ZFN上均开展了相关研究，但是侧重于CRISPR领域，其近年来主要围绕CRISPR和TALEN技术在水稻等作物中的应用开展相关研究。爱荷华州立大学和明尼苏达大学以合作方式发表了多篇基因组编辑相关的研究论文，是最早从事TALEN技术研究的机构之一，在TALEN等技术上具有领先优势。
从合作关系上看，TOP20机构合作彼此紧密，中国科学院与美国普渡大学的合作数量最多(15篇)，且主要集中在2013~2017年，研究内容涉及CRISPR/Cas系统、CRISPR-Cpf1系统、diRNAs和转录因子等。
▲作物基因组编辑技术发文TOP20机构合作网络
爱荷华州立大学、明尼苏达大学、哈佛大学、内布拉斯加大学和加州大学戴维斯分校等美国大学之间的合作关系也较为密切，主要涉及遗传转化、转录激活因子、定向诱变和CRISPR-Cpf1系统等内容。
此外，日本国家农业生物科学研究所和日本横滨市立大学的合作关系较为密切，双方在2010~2016年期间共发表了15篇研究论文，主要研究TALEN介导靶向突变、精准定向突变和CRISPR/Cas系统等。
农业跨国公司非常重视
基因组编辑在作物育种中的应用
作物育种是基因组编辑技术最重要的应用之一，目前多数重要农业跨国企业通过技术转让和合作方式纷纷进入该领域。
目前，基因组编辑技术已经应用于育种实践，并培育出多个作物新品种(品系)，其中一些品种已申请解除转基因管制。
拜耳公司的科学家已利用该技术培育出了具有抗虫性和抗除草剂的棉花品系，未来该技术还可以用于水稻和大豆品种的改良。
杜邦公司已经获得了CRISPR技术编辑的玉米和小麦新品系，并将开展相关的大田试验，并预计到2020年底将会出售用CRISPR技术编辑的种子，其中基于CRISPR-Cas育种技术研制的糯玉米杂交品种已经进入了现场追踪和监管审查阶段。
中国科学院遗传与发育生物学研究所利用基因组编辑技术，首次对六倍体小麦中的MLO基因3个拷贝同时进行了突变，成功获得了对白粉病具有持久和广谱抗性的小麦材料(遗传发育所植物基因编辑技术入选麻省理工科技评论2016年十大技术突破)。
Cellectis和陶氏益农等公司分别利用了TALEN和ZFN等技术培育出马铃薯和玉米新品种，并被美国农业部宣布解除转基因生物安全监管。
宾夕法尼亚州立大学利用CRISPR/Cas9技术研发出具有抗褐变能力的双孢菇，获得美国农业部监管的豁免权。
杜邦先锋、陶氏益农和孟山都等跨国公司在基因组编辑技术的产业化发展进程中起到一定的引领和推动作用，主要通过与基因组编辑主要研发者的技术转让和合作方式纷纷进入该领域，并利用CRISPR等最新基因组编辑技术获得了玉米和小麦等作物新品种，以期在未来利用基因组编辑技术进行农作物品种改良中能占有一席之地。
尽管我国近年来在基因组编辑研究中取得了较大进步，论文数量和专利数量分别位居全球第二位和第三位，但由于现有的基因组编辑技术的核心专利基本被国外机构所垄断，相关产业发展仍受制于人。
作者丨李东巧、杨艳萍，作物基因组编辑技术国际发展态势分析，中国科学：生命科学，2019.49（有删改）
编辑丨农财君
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